በBDDE አቋራጭ አውቶክላቭ ውስጥ አዲስ ምላሽ ከ-ምርቶች ማግኘት

ጃቫ ስክሪፕት በአሁኑ ጊዜ በአሳሽዎ ውስጥ ተሰናክሏል።ጃቫስክሪፕት ሲሰናከል የዚህ ድህረ ገጽ አንዳንድ ተግባራት አይሰሩም።
ጃቪዬር ፊዳልጎ፣ * ፒየር-አንቶይን ዴግልስኔ፣ * ሮድሪጎ አሮዮ፣ * ሊሊያን ሴፑልቬዳ፣ * ኢቫንያ ራኔቫ፣ ፊሊፕ ዴፕሬዝ የሳይንስ ክፍል፣ የቆዳ ቴክ ፋርማሲ ቡድን፣ ካስቴሎ ዲኤምፑሪስ፣ ካታሎኒያ፣ ስፔን * እነዚህ ደራሲዎች በዚህ ሥራ ላይ አንዳንድ ግንዛቤዎች አሏቸው። የአስተዋጽኦ ዳራ፡- ሃያዩሮኒክ አሲድ (HA) በተፈጥሮ የተገኘ ፖሊሶካካርዴድ የቆዳ መሙያዎችን ለውበት ዓላማዎች የሚያገለግል ነው።በሰዎች ቲሹዎች ውስጥ የበርካታ ቀናት ግማሽ ህይወት ስላለው, HA-based የቆዳ መሙያዎች በሰውነት ውስጥ ህይወታቸውን ለማራዘም በኬሚካል ተስተካክለዋል.በንግድ HA-based fillers ውስጥ በጣም የተለመደው ማሻሻያ የ 1,4-butanediol diglycidyl ether (BDDE) እንደ ማቋረጫ ወኪል የ HA ሰንሰለቶችን ለማገናኘት መጠቀም ነው.ቀሪ ወይም ያልተለቀቀ BDDE በ<2 ክፍሎች በሚሊየን (ppm) ላይ መርዛማ እንዳልሆነ ይቆጠራል።ስለዚህ የታካሚውን ደህንነት ለማረጋገጥ በመጨረሻው የቆዳ መሙያ ውስጥ ያለው ቀሪው BDDE በቁጥር መቆጠር አለበት።ቁሳቁሶች እና ዘዴዎች፡- ይህ ጥናት ፈሳሽ ክሮማቶግራፊ እና የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ (LC-MS) በማጣመር በአልካላይን ሁኔታዎች ውስጥ በBDDE እና HA መካከል ያለውን የአቋራጭ ምላሽ ውጤት መለየት እና ባህሪን ይገልጻል።ውጤቶች፡ ከተለያዩ ትንታኔዎች በኋላ፣ የ HA-BDDE ሃይድሮጅንን ለመበከል ጥቅም ላይ የዋለው የአልካላይን ሁኔታ እና ከፍተኛ የሙቀት መጠን የዚህ አዲስ ተረፈ ምርት፣ "ፕሮፒሊን ግላይኮል-መሰል" ውህድ እንዲፈጠር አስተዋውቋል።የኤልሲ-ኤምኤስ ትንታኔ አረጋግጧል ተረፈ ምርቱ ከBDDE ጋር አንድ አይነት ሞኖሶቶፒክ፣ የተለየ የማቆያ ጊዜ (tR) እና የተለየ የUV መምጠጥ (λ=200 nm) ሁነታ አለው።እንደ BDDE ሳይሆን፣ በኤልሲ-ኤምኤስ ትንተና በተመሳሳይ የመለኪያ ሁኔታዎች ይህ ተረፈ ምርት በ200 nm ከፍ ያለ የመለየት መጠን እንዳለው በኤልሲ-ኤምኤስ ትንታኔ ተስተውሏል።ማጠቃለያ፡ እነዚህ ውጤቶች በዚህ አዲስ ውህድ መዋቅር ውስጥ ምንም ኢፖክሳይድ እንደሌለ ያመለክታሉ።በ HA-BDDE hydrogel (HA dermal filler) ምርት ላይ የሚገኘውን ይህ አዲስ ተረፈ ምርት ለንግድ ዓላማ ያለውን አደጋ ለመገምገም ውይይቱ ክፍት ነው።ቁልፍ ቃላት: hyaluronic አሲድ, HA የቆዳ መሙያ, የመስቀል-የተገናኘ hyaluronic አሲድ, BDDE, LC-MS ትንተና, BDDE ከ-ምርት.
በሃያዩሮኒክ አሲድ (HA) ላይ የተመሰረቱ ሙላቶች ለመዋቢያነት ጥቅም ላይ የሚውሉት በጣም የተለመዱ እና ታዋቂ የሆኑ የቆዳ መሙያዎች ናቸው.1 ይህ የቆዳ መሙያ ብዙውን ጊዜ> 95% ውሃ እና 0.5-3% HA ሃይድሮጅል ነው, ይህም ጄል-እንደ መዋቅር ይሰጣል.2 HA ፖሊሶካካርዴድ እና የጀርባ አጥንት ውጫዊ ውጫዊ ማትሪክስ ዋና አካል ነው.አንድ ንጥረ ነገሮች.እሱ (1,4) - ግሉኩሮኒክ አሲድ-β (1,3)-N-acetylglucosamine (GlcNAc) በ glycosidic bonds የተገናኙ ተደጋጋሚ የዲስክካርዳይድ ክፍሎችን ያካትታል።ይህ disaccharide ንድፍ በሁሉም ፍጥረታት ውስጥ ተመሳሳይ ነው።ከአንዳንድ ፕሮቲን-ተኮር ሙላቶች (እንደ ኮላጅን ያሉ) ጋር ሲነጻጸር ይህ ንብረት HA በጣም ባዮኬሚካላዊ ሞለኪውል ያደርገዋል።እነዚህ መሙያዎች በታካሚው በሽታ የመከላከል ስርዓት ሊታወቁ የሚችሉትን የአሚኖ አሲድ ቅደም ተከተል ልዩነት ሊያሳዩ ይችላሉ።
እንደ የቆዳ ሙሌት ጥቅም ላይ በሚውልበት ጊዜ, የ HA ዋናው ገደብ hyaluronidases የሚባል የተወሰነ ቤተሰብ ኢንዛይሞች በመኖሩ ምክንያት በቲሹዎች ውስጥ ያለው ፈጣን ለውጥ ነው.እስካሁን ድረስ በቲሹዎች ውስጥ ያለውን የ HA ግማሽ ህይወት ለመጨመር በ HA መዋቅር ውስጥ ብዙ የኬሚካል ማሻሻያዎች ተገልጸዋል.3 አብዛኛዎቹ እነዚህ ማሻሻያዎች hyaluronidase ወደ ፖሊሶክካርራይድ ፖሊመሮች የ HA ሰንሰለቶችን በማገናኘት ተደራሽነትን ለመቀነስ ይሞክራሉ።ስለዚህ በድልድዮች መፈጠር እና በኤችአይኤ መዋቅር እና በአገናኝ መንገዱ መካከል ያለው የ intermolecular covalent bonds በመስቀል-የተገናኘ HA hydrogel ከተፈጥሯዊ HA የበለጠ የፀረ-ኤንዛይም መበላሸት ምርቶችን ያመርታል።4-6
እስካሁን ድረስ የኬሚካል ማቋረጫ ወኪሎች ሜታክሪላሚድ ፣ 7 ሃይድሮዚድ ፣ 8 ካርቦዲሚድ ፣ 9 ዲቪኒል ሰልፎን ፣ 1 ፣4-butanediol diglycidyl ether (BDDE) እና ፖሊ(ኤቲሊን ግላይኮል) ዲግሊሲዲል ኤተርን ያካትታሉ።10፣11 BDDE በአሁኑ ጊዜ በብዛት ጥቅም ላይ የዋለው ማቋረጫ ወኪል ነው።ምንም እንኳን እነዚህ የሃይድሮጂል ዓይነቶች ለአስርተ ዓመታት ደህንነታቸው የተጠበቀ መሆናቸው የተረጋገጠ ቢሆንም፣ ጥቅም ላይ የሚውሉት ማቋረጫ ወኪሎች ሳይቶቶክሲክ እና በአንዳንድ ሁኔታዎች ፣ mutagenic ሊሆኑ የሚችሉ ምላሽ ሰጪዎች ናቸው።12 ስለዚህ በመጨረሻው ሃይድሮጅል ውስጥ ያለው ቀሪ ይዘታቸው ከፍተኛ መሆን አለበት.BDDE ደህንነቱ የተጠበቀ ተደርጎ የሚወሰደው ቀሪው ትኩረት ከ 2 ክፍሎች በአንድ ሚሊዮን (ፒፒኤም) ያነሰ ሲሆን ነው።4
እንደ ጋዝ ክሮማቶግራፊ፣ የመጠን አግላይ ክሮማቶግራፊ ከጅምላ ስፔክትሮሜትሪ (ኤምኤስ) ጋር ተጣምሮ፣ የኑክሌር ማግኔቲክ ድምጽ ማጉያ (NMR) የፍሎረሰንስ መለኪያ ዘዴዎች እና በHA hydrogels ውስጥ ዝቅተኛ-ቅሪት BDDE ትኩረትን፣ ተሻጋሪ ዲግሪ እና የመተካት ቦታን ለመለየት ብዙ ዘዴዎች አሉ። Diode ድርድር ከፍተኛ አፈጻጸም ያለው ፈሳሽ ክሮማቶግራፊ (HPLC) ተጣምሮ።13-17 ይህ ጥናት በ BDDE እና HA በአልካላይን ሁኔታዎች በተፈጠረ ምላሽ የተመረተውን በመጨረሻው ተያያዥነት ባለው HA ሃይድሮጅል ውስጥ ያለውን ተረፈ ምርት መለየት እና ባህሪን ይገልጻል።የ HPLC እና ፈሳሽ ክሮማቶግራፊ-mass spectrometry (LC-MS ትንተና).የዚህ የBDDE ተረፈ ምርት መርዛማነት የማይታወቅ በመሆኑ፣ የተረፈውን መጠኗ በመጨረሻው ምርት ላይ በተለምዶ በBDDE ላይ ከሚደረገው ዘዴ ጋር በሚመሳሰል መልኩ እንዲወሰን እንመክራለን።
የተገኘው የሶዲየም ጨው HA (Shiseido Co., Ltd., ቶኪዮ, ጃፓን) የሞለኪውላዊ ክብደት ~ 1,368,000 ዳ (ሎረንት ዘዴ) 18 እና ውስጣዊ ስ 2.20 m3 / ኪግ.ለተሻጋሪ ምላሽ፣ BDDE (≥95%) የተገዛው ከሲግማ-አልድሪች ኩባንያ (ሴንት ሉዊስ፣ MO፣ USA) ነው።ከሲግማ-አልድሪች ኩባንያ የተገዛው ፎስፌት የተከለለ ሳላይን በፒኤች 7.4 ነው።በ LC-MS ትንተና ውስጥ ጥቅም ላይ የዋሉ ሁሉም ፈሳሾች፣ አሴቶኒትሪል እና ውሃ የተገዙት ከ HPLC ደረጃ ጥራት ነው።ፎርሚክ አሲድ (98%) የተገዛው እንደ ሪጀንት ደረጃ ነው።
ሁሉም ሙከራዎች የተከናወኑት በUPLC Acquity ሲስተም (ውተርስ፣ ሚልፎርድ፣ ኤምኤ፣ ዩኤስኤ) እና ከኤፒአይ 3000 ባለሶስት ባለአራት ጅምላ ስፔክትሮሜትር ጋር የተገናኘ ኤሌክትሮስፕሬይ ionization ምንጭ (AB SCIEX፣ Framingham, MA, USA) ነው።
የተሻገሩ HA hydrogels ውህደት የተጀመረው 198 mg BDDE ወደ 10% (ወ/ወ) ሶዲየም ሃይሎሮንቴት (ናኤችኤ) መፍትሄ በ 1% አልካሊ (ሶዲየም ሃይድሮክሳይድ፣ ናኦኤች) ውስጥ በመጨመር ነው።በምላሹ ድብልቅ ውስጥ ያለው የመጨረሻው የBDDE ትኩረት 9.9 mg/mL (0.049 ሚሜ) ነው።ከዚያም የምላሹ ድብልቅ በደንብ የተደባለቀ እና ተመሳሳይነት ያለው እና በ 45 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ለ 4 ሰዓታት እንዲቆይ ይደረጋል.19 የምላሹ ፒኤች በ ~ 12 ይጠበቃል።
ከዚያ በኋላ፣ የምላሽ ውህዱ በውሃ ታጥቧል፣ እና የመጨረሻው HA-BDDE ሃይድሮጄል ተጣርቶ በፒቢኤስ ቋት ተዳፍኖ የHA መጠን ከ10 እስከ 25 mg/mL እና የመጨረሻው ፒኤች 7.4።የሚመረተውን ተሻጋሪ HA hydrogels ማምከን እንዲቻል እነዚህ ሁሉ ሀይድሮጀሎች በራስ ክላቭድ (120 ° ሴ ለ 20 ደቂቃዎች) ናቸው።የተጣራው BDDE-HA ሃይድሮጅል በ 4 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ እስከ ትንተና ድረስ ተከማችቷል.
ከተሻጋሪው የ HA ምርት ውስጥ ያለውን BDDE ለመተንተን፣ 240 ሚ.ግ ናሙና ተመዝኖ ወደ መሃልኛው ጉድጓድ (ማይክሮኮን®፣ ሜርክ ሚሊፖሬ፣ ቢሌሪካ፣ ኤምኤ፣ ዩኤስኤ፣ ጥራዝ 0.5 ሚሊ ሊትር) እና በክፍል ሙቀት በ10,000 ራፒኤም ሴንትሪፉድ ተደረገ። 10 ደቂቃበአጠቃላይ 20µL ወደ ታች የሚጎትት ፈሳሽ ተሰብስቦ ተተነተነ።
በአልካላይን ሁኔታዎች (1% ፣ 0.1% እና 0.01% NaOH) የBDDE ደረጃን (ሲግማ-አልድሪች ኮ) ለመተንተን የሚከተሉት ሁኔታዎች ከተሟሉ የፈሳሽ ናሙና 1፡10፣ 1፡100 ወይም እስከ 1: 1,000,000 አስፈላጊ ከሆነ, ለመተንተን ሚሊኪው ዲዮኒዝድ ውሃ ይጠቀሙ.
በመስቀለኛ መንገድ ምላሽ (HA 2%, H2O, 1% NaOH እና 0.049 mM BDDE) ጥቅም ላይ ለሚውሉት የመነሻ ቁሳቁሶች, ከእነዚህ ቁሳቁሶች የተዘጋጀው እያንዳንዱ ናሙና 1 ሚሊ ሜትር ተመሳሳይ የትንተና ሁኔታዎችን በመጠቀም ተንትኗል.
በአዮን ካርታ ላይ የሚታዩትን የከፍታዎች ልዩነት ለማወቅ 10 µL ከ100 ፒፒቢ BDDE መደበኛ መፍትሄ (ሲግማ-አልድሪች ኮ) ወደ 20 μL ናሙና ተጨምሯል።በዚህ ሁኔታ በእያንዳንዱ ናሙና ውስጥ ያለው የመለኪያ የመጨረሻው ትኩረት 37 ፒ.ቢ.
በመጀመሪያ የ BDDE ክምችት መፍትሄ በ 11,000 mg/L (11,000 ppm) በ 10 μL መደበኛ BDDE (Sigma-Aldrich Co) በ 990 μL MilliQ ውሃ (density 1.1 g/mL) በማጣራት ያዘጋጁ።110 μg/L (110 ppb) BDDE መፍትሄ እንደ መካከለኛ መደበኛ ዳይሉሽን ለማዘጋጀት ይህንን መፍትሄ ይጠቀሙ።ከዚያም የሚፈለገውን የ 75, 50, 25, 10, እና 1 pb መጠን ለማግኘት መካከለኛውን የቢዲዲኢ ስታንዳርድ ዳይሬንት (110 ፒ.ፒ.ቢ) ይጠቀሙ።በስእል 1 ላይ እንደሚታየው የBDDE መደበኛ ኩርባ ከ 1.1 እስከ 110 ፒ.ፒ.ቢ. ጥሩ መስመራዊነት (R2>0.99) እንዳለው ታውቋል።መደበኛው ኩርባ በአራት ገለልተኛ ሙከራዎች ተደግሟል።
ምስል 1 የ BDDE መደበኛ የካሊብሬሽን ጥምዝ በኤልሲ-ኤምኤስ ትንተና የተገኘ ሲሆን በውስጡም ጥሩ ቁርኝት የሚታይበት (R2> 0.99)።
አጽሕሮተ ቃላት: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS, ፈሳሽ ክሮማቶግራፊ እና የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ.
በመሠረታዊ መፍትሔው ውስጥ የሚገኙትን የBDDE ደረጃዎችን ለመለየት እና ለመለካት በኤች.አይ.ዲ.ዲ.ኢ.ዲ.ዲ.ዲ.ዲ.ዲ.ዲ.ዲ.ዲ.ዲ.ዲ.ዲ.ዲ.ዲ.ዲ.ዲ.ዲ.ዲ.ዲ.ኢ.ስታንዳርድ.
ክሮማቶግራፊ መለያው የተገኘው በLUNA 2.5 µm C18(2) -HST አምድ (50×2.0 mm2፤ Phenomenex, Torrance, CA, USA) እና በክፍል ሙቀት (25 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ) ላይ በመተንተን ተይዟል።የሞባይል ደረጃ 0.1% ፎርሚክ አሲድ የያዘ አሴቶኒትሪል (ሟሟ A) እና ውሃ (ሟሟ ቢ) ያካትታል።የተንቀሳቃሽ ስልክ ደረጃ በግራዲየንት ኢልቴሽን ተለቀቀ።ቅልጥፍናው እንደሚከተለው ነው-0 ደቂቃዎች, 2% A;1 ደቂቃ, 2% A;6 ደቂቃዎች, 98% A;7 ደቂቃዎች, 98% A;7.1 ደቂቃዎች, 2% A;10 ደቂቃ፣ 2% ሀ. የሩጫ ጊዜው 10 ደቂቃ ሲሆን የክትባት መጠኑ 20µL ነው።የBDDE የማቆያ ጊዜ ወደ 3.48 ደቂቃዎች ነው (በሙከራዎች ላይ የተመሰረተ ከ 3.43 እስከ 4.14 ደቂቃዎች)።የሞባይል ደረጃ ለ LC-MS ትንተና በ 0.25 mL / ደቂቃ ፍሰት ፍጥነት ተጭኗል.
ለ BDDE ትንተና እና መጠን በ MS የ UPLC ስርዓት (ውሃዎች) ከኤፒአይ 3000 ባለሶስት ባለአራት ኳድ ስፔክትሮሜትር (AB SCIEX) ጋር በኤሌክትሮስፕሬይ ionization ምንጭ የተገጠመለት እና ትንታኔው በአዎንታዊ ion ሁነታ (ESI +) ውስጥ ይከናወናል.
በ BDDE ላይ በተካሄደው የ ion ፍርፋሪ ትንታኔ መሰረት, ከፍተኛ ጥንካሬ ያለው ክፍልፋይ ከ 129.1 ዳ (ስእል 6) ጋር የሚመጣጠን ቁርጥራጭ እንዲሆን ተወስኗል.ስለዚህ, በባለብዙ-ion ክትትል ሁነታ (MIM) ለመለካት, የ BDDE የጅምላ ልወጣ (ከጅምላ ወደ-ቻርጅ ጥምርታ [m/z]) 203.3/129.1 ዳ ነው.እንዲሁም ለኤልሲ-ኤምኤስ ትንተና ሙሉ ስካን (ኤፍኤስ) ሁነታ እና የምርት ion ስካን (PIS) ሁነታን ይጠቀማል።
የስልቱን ልዩነት ለማረጋገጥ, ባዶ ናሙና (የመጀመሪያው የሞባይል ደረጃ) ተተነተነ.203.3/129.1 ዳ በጅምላ ልወጣ በባዶ ናሙና ውስጥ ምንም ምልክት አልተገኘም።የሙከራውን ተደጋጋሚነት በተመለከተ 10 መደበኛ መርፌዎች 55 ፒ.ፒ.ቢ (በመለኪያ ከርቭ መካከል) ተተነተኑ፣ በዚህም ምክንያት ቀሪ መደበኛ መዛባት (RSD) <5% (መረጃ አልተገለጸም)።
የቀረው የBDDE ይዘት በስምንት የተለያዩ ራስ-ክላቭድ BDDE ተሻጋሪ HA hydrogels ውስጥ ተቆጥሯል፣ ይህም ከአራት ነጻ ሙከራዎች ጋር ይዛመዳል።በ "ቁሳቁሶች እና ዘዴዎች" ክፍል ላይ እንደተገለፀው መጠኑ የሚገመገመው በ BDDE መደበኛ dilution የመመለሻ ኩርባ አማካኝ ዋጋ ነው ፣ ይህም በ BDDE የጅምላ ሽግግር 203.3 / 129.1 ዳ ላይ ከተገኘው ልዩ ጫፍ ጋር ይዛመዳል ፣ ከማቆየት ጋር። ጊዜ ከ 3.43 እስከ 4.14 ደቂቃዎች በመጠባበቅ ላይ አይደለም.ምስል 2 የ10 ppb BDDE ማጣቀሻ ስታንዳርድ ምሳሌ chromatogram ያሳያል።ሠንጠረዥ 1 የስምንት የተለያዩ ሀይድሮጀሎች ቀሪ የBDDE ይዘትን ያጠቃልላል።የእሴቱ ክልል ከ1 እስከ 2.46 ፒፒቢ ነው።ስለዚህ፣ በናሙናው ውስጥ ያለው ቀሪ የBDDE ትኩረት ለሰው ጥቅም ተቀባይነት አለው (<2 ppm)።
ምስል 2 Ion chromatogram of 10 ppb BDDE የማጣቀሻ መስፈርት (ሲግማ-አልድሪች ኮ)፣ MS (m/z) በLC-MS ትንተና በ203.30/129.10 ዳ (በአዎንታዊ MRM ሁነታ) የተገኘው ሽግግር።
አጽሕሮተ ቃላት: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS, ፈሳሽ ክሮሞግራፊ እና የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ;MRM, ባለብዙ ምላሽ ክትትል;ኤምኤስ, ክብደት;m/z፣ ከጅምላ ወደ ክፍያ ሬሾ።
ማሳሰቢያ፡- ናሙናዎች 1-8 በራስ-የተጣበቁ BDDE አቋራጭ HA hydrogels ናቸው።በሃይድሮጄል ውስጥ ያለው የBDDE ቀሪ መጠን እና ከፍተኛው የBDDE የማቆያ ጊዜም ሪፖርት ተደርጓል።በመጨረሻም፣ የተለያዩ የማቆያ ጊዜዎች ያላቸው አዳዲስ ጫፎች መኖራቸውም ተዘግቧል።
አጽሕሮተ ቃላት: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;HA, hyaluronic አሲድ;MRM, ባለብዙ ምላሽ ክትትል;tR, የማቆያ ጊዜ;LC-MS, ፈሳሽ ክሮሞግራፊ እና የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ;RRT፣ አንጻራዊ የማቆያ ጊዜ።
በሚገርም ሁኔታ የኤልሲ-ኤምኤስ ion ክሮማቶግራም ትንታኔ እንደሚያሳየው በሁሉም የራስ-ክላቭድ መስቀል-ተያያዥ የ HA ሃይድሮጅል ናሙናዎች ላይ በመመርኮዝ ከ 2.73 እስከ 3.29 ደቂቃዎች ባለው አጭር የማቆያ ጊዜ ላይ ተጨማሪ ከፍተኛ ደረጃ ተገኝቷል ።ለምሳሌ፡ ስእል 3 የ ion ክሮማቶግራም ከመስቀል-የተገናኘ HA ናሙና ያሳያል፡ ተጨማሪ ጫፍ ደግሞ በግምት 2.71 ደቂቃ ያህል በተለየ የማቆያ ጊዜ ይታያል።በአዲሱ የታየ ከፍተኛ እና ከBDDE ጫፍ መካከል ያለው አንጻራዊ የማቆያ ጊዜ (አርቲቲ) 0.79 ሆኖ ተገኝቷል (ሠንጠረዥ 1)።በኤልሲ-ኤምኤስ ትንተና ውስጥ ጥቅም ላይ በሚውለው የC18 አምድ ውስጥ አዲስ የታየው ጫፍ ብዙም እንደሚቆይ ስለምናውቅ፣ አዲሱ ጫፍ ከBDDE የበለጠ የዋልታ ውህድ ጋር ሊዛመድ ይችላል።
ምስል 3 Ion chromatogram በ LC-MS (ኤምአርኤም የጅምላ ልወጣ 203.3/129.0 ዳ) የተገኘ የመስቀል-የተገናኘ HA hydrogel ናሙና.
አጽሕሮተ ቃላት: HA, hyaluronic አሲድ;LC-MS, ፈሳሽ ክሮሞግራፊ እና የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ;MRM, ባለብዙ ምላሽ ክትትል;RRT, አንጻራዊ የማቆያ ጊዜ;tR, የማቆያ ጊዜ.
የተስተዋሉት አዳዲስ ቁንጮዎች በመጀመሪያ ጥቅም ላይ በሚውሉት ጥሬ ዕቃዎች ውስጥ ብክለት ሊሆኑ እንደሚችሉ ለማስወገድ, እነዚህ ጥሬ ዕቃዎችም በተመሳሳይ የ LC-MS ትንተና ዘዴ ተንትነዋል.የተተነተኑት የመነሻ ቁሶች ውሃ፣ 2% NHA በውሀ፣ 1% ናኦኤች በውሃ ውስጥ እና BDDE በተመሳሳዩ አተኩሮ ተያያዥነት ባለው ምላሽ ያካትታሉ።ጥቅም ላይ የዋለው የመነሻ ቁሳቁስ ion ክሮሞግራም ምንም አይነት ውህድ ወይም ጫፍ አላሳየም, እና የማቆየት ጊዜው ከሚታየው አዲስ ጫፍ ጋር ይዛመዳል.ይህ እውነታ የመነሻ ቁሳቁስ ብቻ ሳይሆን በመተንተን ሂደት ውስጥ ጣልቃ የሚገቡ ማናቸውንም ውህዶች ወይም ንጥረ ነገሮች ሊያካትት ይችላል የሚለውን ሀሳብ ያስወግዳል, ነገር ግን ከሌሎች የላቦራቶሪ ምርቶች ጋር መበከል የሚችል ምንም ምልክት የለም.ከኤልሲ-ኤምኤስ የBDDE ትንተና በኋላ የተገኙት የማጎሪያ ዋጋዎች በሰንጠረዥ 2 (ናሙናዎች 1-4) እና በስእል 4 ውስጥ ion chromatogram ይታያሉ።
ማሳሰቢያ፡- ናሙናዎች 1-4 አውቶክላቭድ BDDE ተሻጋሪ የ HA ሃይድሮጅሎችን ለማምረት ጥቅም ላይ ከሚውሉት ጥሬ ዕቃዎች ጋር ይዛመዳሉ።እነዚህ ናሙናዎች አውቶማቲክ አልነበሩም.
አጽሕሮተ ቃላት: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;HA, hyaluronic አሲድ;LC-MS, ፈሳሽ ክሮሞግራፊ እና የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ;MRM፣ ባለብዙ ምላሽ ክትትል።
ምስል 4 በ HA እና BDDE አቋራጭ ምላሽ ውስጥ ጥቅም ላይ የዋለው የጥሬ ዕቃ ናሙና ከ LC-MS chromatogram ጋር ይዛመዳል።
ማሳሰቢያ፡- እነዚህ ሁሉ የሚለካው የአገናኝ መንገዱን ምላሽ ለማስፈጸም በሚውል ተመሳሳይ ትኩረት እና ጥምርታ ነው።በክሮሞግራም የተተነተኑ የጥሬ ዕቃዎች ቁጥሮች (1) ውሃ ፣ (2) 2% HA የውሃ መፍትሄ ፣ (3) 1% የናኦኤች የውሃ መፍትሄ።የ LC-MS ትንተና የሚከናወነው ለ 203.30/129.10 ዳ (በአዎንታዊ MRM ሁነታ) በጅምላ ለመለወጥ ነው.
አጽሕሮተ ቃላት: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;HA, hyaluronic አሲድ;LC-MS, ፈሳሽ ክሮሞግራፊ እና የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ;MRM፣ ባለብዙ ምላሽ ክትትል።
አዳዲስ ቁንጮዎች እንዲፈጠሩ ምክንያት የሆኑት ሁኔታዎች ተጠንተዋል.መስቀል-የተገናኘ HA hydrogel ለማምረት ጥቅም ላይ የሚውሉት የምላሽ ሁኔታዎች የ BDDE ተሻጋሪ ወኪል ምላሽን እንዴት እንደሚነኩ ለማጥናት ፣ ይህም ወደ አዲስ ጫፎች (ምርቶች ሊሆኑ የሚችሉ) ይመራሉ ፣ የተለያዩ ልኬቶች ተካሂደዋል።በእነዚህ ውሣኔዎች ውስጥ፣ በተለያዩ የናኦኤች መጠን (0%፣ 1%፣ 0.1% እና 0.01%) በውኃ ውስጥ በሚታከም፣ ተከትሎም ሆነ ያለ autoclaving የተደረገውን የመጨረሻውን BDDE crosslinker አጥንተን ተንትነናል።ተመሳሳይ ሁኔታዎችን ለመምሰል የባክቴሪያ አሰራር ዘዴ የተሻጋሪውን HA ሃይድሮጅን ለማምረት ጥቅም ላይ ከሚውለው ዘዴ ጋር ተመሳሳይ ነው.በ "ቁሳቁሶች እና ዘዴዎች" ክፍል ውስጥ እንደተገለፀው የናሙና የጅምላ ሽግግር በ LC-MS ወደ 203.30 / 129.10 ዳ.የ BDDE እና የአዲሱ ጫፍ መጠን ይሰላል, ውጤቱም በሰንጠረዥ 3 ውስጥ ይታያል. ምንም እንኳን ናኦኤች (ናሙናዎች 1-4, ሠንጠረዥ) ውስጥ መገኘት ምንም ይሁን ምን, አውቶማቲክ ባልሆኑ ናሙናዎች ውስጥ ምንም አዲስ ጫፎች አልተገኙም. 3)ለ autoclaved ናሙናዎች, አዲስ ቁንጮዎች መፍትሔ ውስጥ NaOH ፊት ላይ ብቻ ተገኝቷል, እና ጫፍ ምስረታ ወደ መፍትሄ ውስጥ NaOH ትኩረት (ናሙና 5-8, ሠንጠረዥ 3) (RRT = 0.79) ላይ የሚወሰን ይመስላል.ምስል 5 የ ion chromatogram ምሳሌ ያሳያል, ሁለት አውቶክላቭድ ናሙናዎችን በNAOH መኖር እና አለመኖር ያሳያል.
አጽሕሮተ ቃላት: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS, ፈሳሽ ክሮሞግራፊ እና የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ;MRM፣ ባለብዙ ምላሽ ክትትል።
ማሳሰቢያ፡ የላይኛው ክሮማቶግራም፡ ናሙናው በ0.1% NaOH aqueous መፍትሄ እና በራስ ክላቭድ (120°C ለ20 ደቂቃ) ታክሟል።የታችኛው ክሮማቶግራም፡ ናሙናው በNaOH አልታከመም፣ ነገር ግን በተመሳሳዩ ሁኔታዎች ውስጥ በራስ-የተሰራ።የ 203.30 / 129.10 ዳ (በአዎንታዊ MRM ሁነታ) የጅምላ ልወጣ በ LC-MS ተተነተነ.
አጽሕሮተ ቃላት: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS, ፈሳሽ ክሮሞግራፊ እና የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ;MRM፣ ባለብዙ ምላሽ ክትትል።
በሁሉም የራስ-ክላቭድ ናሙናዎች, ከናኦኤች ጋር ወይም ያለሱ, የ BDDE ትኩረት በከፍተኛ ሁኔታ ቀንሷል (እስከ 16.6 ጊዜ) (ናሙናዎች 5-8, ሠንጠረዥ 2).የBDDE ትኩረትን መቀነስ በከፍተኛ ሙቀት ውስጥ ውሃ እንደ መሰረት (ኑክሊዮፊል) የ BDDE ኤፖክሳይድ ቀለበት ለመክፈት 1,2-diol ውሁድ ሊሆን ስለሚችል ሊሆን ይችላል.የዚህ ውህድ ሞኖሶቶፒክ ጥራት ከBDDE የተለየ ስለሆነ አይነካም።LC-MS የ 203.30/129.10 ዳ የጅምላ ፈረቃ ተገኝቷል።
በመጨረሻም, እነዚህ ሙከራዎች እንደሚያሳዩት የአዳዲስ ጫፎች መፈጠር በ BDDE, NAOH እና በ autoclaving ሂደት ላይ የተመሰረተ ነው, ነገር ግን ከ HA ጋር ምንም ግንኙነት የለውም.
በግምት 2.71 ደቂቃዎች ባለው የማቆያ ጊዜ የተገኘው አዲሱ ከፍተኛ ጫፍ በ LC-MS ተለይቷል።ለዚሁ ዓላማ, BDDE (9.9 mg / mL) በ 1% NaOH aqueous መፍትሄ እና በራስ-የተሰራ.በሰንጠረዥ 4 ውስጥ የአዲሱ ጫፍ ባህሪያት ከሚታወቀው የBDDE ማጣቀሻ ጫፍ (የማቆያ ጊዜ በግምት 3.47 ደቂቃዎች) ጋር ተነጻጽሯል.በሁለቱ ጫፎች ላይ ባለው የ ion ቁርጥራጭ ትንተና ላይ በመመርኮዝ በ 2.72 ደቂቃዎች የማቆያ ጊዜ ያለው ጫፍ ከ BDDE ጫፍ ጋር ተመሳሳይ የሆኑ ቁርጥራጮችን ያሳያል, ነገር ግን በተለያየ ጥንካሬ (ምስል 6) ላይ መደምደም ይቻላል.ከ 2.72 ደቂቃዎች የማቆያ ጊዜ (ፒአይኤስ) ጋር ለሚዛመደው ከፍተኛ መጠን በ 147 ዳ ብዛት ከተከፋፈሉ በኋላ የበለጠ ኃይለኛ ጫፍ ታይቷል ።በዚህ ውሳኔ ውስጥ ጥቅም ላይ በሚውለው የBDDE ትኩረት (9.9 mg / ml) ፣ በአልትራቫዮሌት ስፔክትረም ውስጥ የተለያዩ የመሳብ ዘዴዎች (UV ፣ λ=200 nm) እንዲሁ ከክሮሞግራፊ መለያየት በኋላ ታይቷል (ምስል 7)።የ 2.71 ደቂቃዎች የማቆያ ጊዜ ያለው ከፍተኛው አሁንም በ200 nm ይታያል, የ BDDE ጫፍ በተመሳሳይ ሁኔታ በ chromatogram ውስጥ ሊታይ አይችልም.
ሠንጠረዥ 4 የአዲሱ ጫፍ ባህሪ ውጤቶች ወደ 2.71 ደቂቃዎች የማቆያ ጊዜ እና የBDDE ከፍተኛ የማቆያ ጊዜ 3.47 ደቂቃዎች
ማሳሰቢያ: እነዚህን ውጤቶች ለማግኘት, LC-MS እና HPLC ትንታኔዎች (ኤምአርኤም እና ፒአይኤስ) በሁለቱ ጫፎች ላይ ተካሂደዋል.ለ HPLC ትንተና, ከ 200 nm የሞገድ ርዝመት ጋር UV ማወቂያ ጥቅም ላይ ይውላል.
አጽሕሮተ ቃላት: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;HPLC, ከፍተኛ አፈፃፀም ፈሳሽ ክሮማቶግራፊ;LC-MS, ፈሳሽ ክሮሞግራፊ እና የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ;MRM, ባለብዙ ምላሽ ክትትል;m / z, የጅምላ-ወደ-ክፍያ ሬሾ;PIS, የምርት ion ቅኝት;አልትራቫዮሌት, አልትራቫዮሌት ብርሃን.
ማሳሰቢያ: የጅምላ ቁርጥራጮች በ LC-MS ትንተና (ፒአይኤስ) የተገኙ ናቸው.ከፍተኛ ክሮማቶግራም፡ የBDDE መደበኛ ናሙና ቁርጥራጮች የጅምላ ስፔክትረም።የታችኛው ክሮማቶግራም፡ የተገኘው የአዲሱ ጫፍ የጅምላ ስፔክትረም (አርቲቲ ከBDDE ጫፍ 0.79 ነው)።BDDE በ1% ናኦኤች መፍትሄ ተሰራ እና በራስ ክላቭድ ተደርጓል።
አጽሕሮተ ቃላት: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS, ፈሳሽ ክሮሞግራፊ እና የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ;MRM, ባለብዙ ምላሽ ክትትል;PIS, የምርት ion ቅኝት;RRT፣ አንጻራዊ የማቆያ ጊዜ።
ምስል 7 Ion chromatogram የ 203.30 Da precursor ion, እና (A) አዲሱ ጫፍ 2.71 ደቂቃዎች የማቆያ ጊዜ እና (ለ) የ BDDE ማጣቀሻ ደረጃን የ UV ማወቂያ በ 3.46 ደቂቃዎች በ 200 nm.
በሁሉም የተሻገሩ HA hydrogels ውስጥ, ከ LC-MS መጠን በኋላ ያለው የ BDDE ክምችት <2 ppm, ነገር ግን በመተንተን ውስጥ አዲስ ያልታወቀ ጫፍ ታየ.ይህ አዲስ ጫፍ ከBDDE መደበኛ ምርት ጋር አይዛመድም።የBDDE መደበኛ ምርት በአዎንታዊ የኤምአርኤም ሁነታ ላይ ተመሳሳይ የጥራት ልወጣ (MRM ልወጣ 203.30/129.10 ዳ) ትንታኔ ወስዷል።በአጠቃላይ፣ እንደ ክሮማቶግራፊ ያሉ ሌሎች የትንታኔ ዘዴዎች BDDE በሃይድሮግልስ ውስጥ ለመለየት እንደ ገደብ ፈተናዎች ጥቅም ላይ ይውላሉ፣ ነገር ግን ከፍተኛው የማወቅ ገደብ (LOD) ከ2 ፒፒኤም በትንሹ ያነሰ ነው።በሌላ በኩል፣ እስካሁን፣ NMR እና MS በስኳር አሃድ ቁርጥራጭ የHA ምርቶች ውስጥ ያለውን የግንኙነት ደረጃ እና/ወይም ማሻሻያ ደረጃን ለመለየት ጥቅም ላይ ውለዋል።የነዚህ ቴክኒኮች አላማ በዚህ መጣጥፍ እንደገለፅነው የቀረውን የBDDE ማወቂያን በዝቅተኛ መጠን ለመለካት ሆኖ አያውቅም (LOD of our LC-MS method = 10 ppb)።